PGT - strukturní chromozomová vada (PGT-SR)

Preimplantační genetické testování strukturních chromozomových vad u embryí s cílem identifikovat nebalancovaná a aneuploidní embrya a vyloučit je z transferu. Dle typu a velikosti strukturní chromozomové vady se provádí buď metodou NGS, anebo SNP array.

Cílem primplantačního genetického testování strukturních chromozomových vad (PGT-SR) u embryí metodou NGS je stanovit počet kopií chromozomů, nebo jejich částí a identifikovat embrya vzniklá z nebalancovaných gamet nositele strukturní chromozomové vady. Touto metodou je možné běžně vyšetřit všechny strukturní chromozomové vady zahrnující alespoň jeden úsek chromozomu o velikosti větší než 5 Mbp (miliónů párů bází). Máme-li před vyšetřením k dispozici přesný popis strukturní chromozomové vady, je možné spolehlivě detekovat nebalancovaná embrya s rozilišením až 0,25 Mbp. Průběh a princip vyšetření je stejný jako u PGT aneuploidií (PGT-A) a v rámci vyšetření jsou zároveň vyšetřeny odchylky v počtu chromozomů, nebo jejich částí u všech ostatních chromozomů bez strukturní vady. V případě balancovaných strukturních chromozomových vad u jednoho z rodičů  není možné tímto vyšetřením rozlišit embrya vzniklá z balancovaných gamet od embryí vzniklých z gamet nesoucích strukturně normální chromozomy. Stanovení počtu kopií je založeno na porovnání zastoupení sekvencí ze všech oblastí genomu, a to jak v rámci vzorku, tak zejména v porovnání s referenčním vzorkem o normálním počtu kopií všech chromozomů.

Vstupním vzorkem je 5-10 buněk trofektodermu odebraných 5. – 6. den vývoje embrya ve stádiu blastocysty. Buňky jsou nejprve zlyzovány a uvolněná DNA je amplifikována metodou celogenomové amplifikace na principu DOP-PCR. V posledním amplifikačním kroku jsou k amplifikovaným sekvencím původem z embrya přidány sekvence, které umožní vytvoření knihovny pro masivně paralelní sekvenování, pro které používáme označení NGS. Sekvenační data jsou digitálně vyhodnocena sérií aplikací s cílem přiřadit získané sekvence k jednotlivému embryu (přibližně 5,5 milionů sekvencí o délce 75 nukleotidů na každé embryo), namapovat získané sekvence na referenční genom a určit jejich pozici původu a počet pro jednotlivé úseky genomu. Počty získaných sekvencí z jednotlivých úseků chromozomů jsou porovnány v rámci vzorku a vzhledem k referenčnímu vzorku o normálním počtu chromozomů. Sekvence původem z mitochondriální DNA jsou využity jako další vrstva kontroly kvality práce v laboratoři a mohou být využity ke vzájemnému jednoznačnému rozlišení skupin embryí původem od jednotlivých pacientek. Ze získaných dat je možné dále provést analýzu alelické četnosti u dostatečně pokrytých SNP markerů a kromě aneuploidií chromozomů detekovat rovněž abnormálně fertilizovaná embrya s haploidním, či triploidním počtem sad chromozomů.

Normálním počtem chromozomů se rozumí dvě kopie chromozomů 1-22, dvě kopie chromozomu X u embryí ženského pohlaví a po jedné kopii chromozomů X a Y u embryí mužského pohlaví. Embrya s normálním počtem kopií označujeme jako euploidní. Patologickými nálezy – aneuploidiemi – jsou trizomie v případě nadbytečné kopie, nebo monozomie v případě chybějící kopie příslušného chromozomu, nebo jeho části. Odchylky od normálního počtu chromozomů oběma směry je možné vyjádřit v procentech a stanovit intervaly pro hodnocení počtu kopií. Za normální se považují odchylky do 30 %. Jako trizomie, nebo monozomie se označují odchylky nad 70 %. Nízkými mozaikami se rozumí odchylky v intervalu 30-50 % a jako vysoké mozaiky se označují odchylky v rozmezí 50-70 %. Odchylky zahrnující pouze část chromozomu se nazývají segmentální aneuploidie. Na základě výsledku vyšetření jsou embrya doporučena, nebo nedoporučena k transferu. Pro euploidní embrya a patologická aneuploidní embrya nevhodná k transferu je diagnostická spolehlivost vyšetření větší než 97 %. Z důvodu mozaicismu přirozeně se vyskytujícího u embryí a s ohledem na biologickou charakteristiku primárního vzorku (5 – 10 buněk embrya) není možné dosáhnout vyšší spolehlivosti vyšetření.

Za neživotaschopná se v rámci PGT-A metodou NGS považují embrya nesoucí nebalancovanou strukturní chromozomovou vadu, nebo aneuploidii celého chromozomu s odchylkou od normálního počtu chromozomů větší než 70 %. Takové aneuploidie jsou s největší pravděpodobností původem z gamety, vyskytují se u všech buněk embrya a nejsou slučitelné s dalším vývojem plodu ve zdravého jedince. Vyloučením těchto embryí z transferu je možné v rámci IVF dosáhnout vyššího podílu implantovaných embryí po transferu, snížit riziko potracení plodu v důsledku aneuploidie a zkrátit dobu léčby potřebnou k narození zdravého dítěte.